Radio de Imágenes 

MetaFluor puede adquirir cinco longitudes de onda en cada punto. Después son agrupadas en dos pares de longitudes de onda radiométricas, y una isosbéstica ó imagen de luz transmitida. Con este arreglo, es posible monitorear dos indicadores, tales cono el BCECF (para pH) y fura-2 (para calcio) mientras que a la vez obtiene una imagen de fase de la estructura de la célula. Claro que cada longitud de onda puede ser apagada, así que el mínimo que puede adquirir es una longitud por punto de tiempo, lo que es aceptable para medir la intensidad básica sobre el tiempo, o monitorear una tinción no radiométrica como el fluo3. 

Realizando Mediciones 

Las regiones de interés de cualquier forma o tamaño pueden ser colocados en cualquiera de las imágenes fuentes o el radio de la imagen para monitorear la intensidad de la imagen, valor del radio o concentración de ion. Se pueden hacer mediciones simultáneamente en todas las regiones de interés, y actualizarse continuamente en una gráfica deslizable – permitiéndole seguir los cambios mientras esto sucede en sus células vivas. Además, las imágenes se pueden ampliar para asistir en la selección y creación de zonas de interés. Diferentes herramientas de regiones, tales como elipses, cajas, y un rastreador automático, hacen la definición de las regiones algo sencillo. Un sistema flexible de cuatro gráficas le permite seleccionar lo que gráfica y en donde. Comúnmente, los datos de intensidad para todas las regiones y rodas las longitudes de onda se muestran en su propia gráfica, mientras que los trazos de cada radio aparecen en sus propias gráficas. Sin embargo, esto puede ser reconfigurado para tener cada longitud de onda e intensidad en su propia gráfica, o tener todos los datos en una sola gráfica. En cualquier caso, las gráficas le permiten moverse sobre los datos, haciendo fácil monitorear los cambios en una o varias células sobre el tiempo.

Calibración In Situ de fura-2 en células HeLa. Células cargándose en la figura A. La figura B muestra R máximo después de la perfusión de 10 u Mionomicina. R mínima después de la perfusión de 2 uM EGTA en la figura C. Imágenes cortesía de Dr. Randi Silver. Cornell University Medical College NY, NY.

Para ayudar en el aislamiento de las células marcadas, MetaFluor puede aplicar un umbral con niveles de gris a cada imagen obtenida. El uso de este umbral ayuda a reducir los efectos que distraen las señales de bajo nivel como el fondo fluorescente. Este proceso mejora la precisión de los datos obtenidos excluyendo el umbral de regiones del calculo de radio.

Calibración 

MetaFluor se puede calibrar usando la ecuación Grynkiewicz, lo que da como resultado en mostrar la concentración de iones. Estas calibraciones se pueden almacenar en disco para su uso futuro. También puede calibrar a MetaFluor usando series de referencias de calibración titration. Después de medir los radios de varias soluciones de concentraciones de calcio conocidas (o sus valores iónicos) el MetaFluor calibrará el sistema para convertir los radios medidos y las concentraciones actuales. MetaFluor soporta una variedad de ajustes en la curva permitiéndole elegir el más apropiado para su aplicación. Con ambos métodos, es posible calibrar las imágenes en bases de píxel por píxel, o calibrar usando un juego generalizado de constantes aplicados a toda la imagen. El método actual es preferible cuando se miden calibraciones de la imagen in Situ, porque le permite a los compartimientos de la célula tener sus propias calibraciones. El último caso es recomendado para calibraciones en vitro, hecho típicamente a soluciones estándar de los juegos de Molecular Probes.

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