TIRF | Reflexión Fluorescente Total Interna
PALABRAS CLAVE: Fluorescencia, campo amplio, GFP, fluorofóro, A. N., inmersión en aceite, SRIC, TIRF de luz blanca, imagen de lapso de tiempo, resolución, cociente señal a ruido
DEFINICION:
El TIRF, o microscopia de campo evanescente, es una forma de microscopia fluorescente donde la luz de excitación esta confinada a una pequeña área de la interfase del espécimen y el cubre objetos o el frasco de cultivo. El TIRF permite la imagen de moléculas sencillas de escala nanométrica.
TECNOLOGÍA:
Cuando la luz viaja de un medio de alto índice de refracción (por ejemplo, vidrio) a un medio de índice de refracción más bajo (por ejemplo, agua/células) y pega en la interfase de esos medios con un ángulo suficientemente pequeño de incidencia, se previene que la luz se propague en el segundo material y se refleja de regreso en el primero. La luz penetra en el segundo medio (células) solo a una profundidad de unos cientos de nanómetros y cae exponencialmente con la distancia. Por lo tanto la excitación de los fluoróforos, ocurre en un área típica menor a los 100nm en espesor. Al confinar la energía de excitación a esta delgada sección, se obtiene un cociente grande señal entre ruido haciendo posible observar moléculas fluorescentes sencillas.
APLICACIONES:
El TIRF es apropiado para muestras acuosas (por ejemplo, sin fijar, especimenes montados) y adhesión celular a la superficie del vidrio es un pre-requisito para la microscopia TIRF. El TIRF se puede usar para obtener imágenes de pequeñas estructuras o moléculas sencillas. Esta se ha usado para observar; vesículas atravesando endocitosis o exocitosis, trafico de proteínas solas en células, la absorción de proteínas sanguíneas en bio-materiales, adhesión celular a varias superficies, y dinámicas de la liberación de neurotransmisores. También se ha usado para caracterizar arreglos de nanopartículas, transporte de electrones en mitocondrias y membranas fotosintéticas, y las fuerzas ejercidas en la superficie durante el movimiento celular. El TIRF se puede combinar con FRAP y FRET para obtener información de las dinámicas moleculares e interacciones moleculares.
CONFIGURACIÓN DEL MICROSCOPIO:
El TIRF se puede realizar en casi cualquier microscopio de investigación biológica vertical o invertido con una modificación a los epí-iluminadores usados en las técnicas de campo amplio. El TIRF es más fácil de configurar en microscopios invertidos aunque también se pueden usar microscopios verticales. Esta técnica requiere de objetivos TIRF de gran A. N.
SISTEMA RECOMENDADO:
El sistema láser Nikon Eclipse TIRF-2 con el microscopio invertido Ti (Ti-E, Ti-U, Ti-S, Ti-E PFS) con aditamento de epí-fluorescencia y unidad Iluminadora de Onda Evanescente: Láser azul (488) verde (543) rojo (633) junto con los objetivos Nikon dedicados TIRF Plan Apo 60X A. N. 1.45 aceite y TIRF Plan Apo 100x 1.45 de inmersión en aceite. El objetivo TIRF Plan Apo 60X A. N.1.45 de aceite corrige la aberración esférica inducida por los cambios de temperatura en el índice de refracción del aceite de inmersión.
El diseño modular del Ti permite usar al TIRF en combinación con el sistema confocal C1 para brindar imágenes con cociente extremadamente alto señal-entre-ruido en la membrana celular e imágenes 3D de toda la célula. El método SRIC (Contraste de Interferencia Reflectivo de Superficie) puede confirmar los contactos focales antes de cambiar al TIRF.
LIGAS:
TIRF: [microscopyu]
