PA-GFP | PA-GFP (Foto-activable GFP)
PALABRAS CLAVE: GFP, fluorescencia, imagen de células vivas, AOTF, AOM, FRAP, FLIP, confocal, lapso de tiempo
DEFINICION:
Proteína Verde Fluorescente Foto-Activable (PA-GFO) es una forma de GFP en el cual la intensidad fluorescente puede incrementarse 100 veces después de la activación con luz de ~400nm.
TECNOLOGÍA:
La GFP de tipo salvaje existe en dos formas, lo que da aumento a mayores y menores picos de absorción a 397nm y 475nm respectivamente. La intensidad de iluminación a 400nm desplaza la población a la forma de 475mn, por lo tanto incrementando la absorción del pico menor. Esta capacidad para la foto-conversión lleva al desarrollo de PA-GPF. Seleccionando una forma de GF con un pico insignificante a 475nm, la foto-conversión produce un mayor incremento proporcional en la absorción 475nm comparado con la GFP estándar – y por lo tanto incremente el contraste. La PA-GFP exhibe una muy débil emisión verde (máx. 517nm) después de excitación a 488nm y puede ser activada ~100 veces por la estimulación con luz de 405nm.
APLICACIONES:
La PA-GFP es útil para el estudio de dinámicas temporales y espaciales de proteínas en células vivas o el rastreo de células vivas en una población des células o en un tejido. Después de la activación, se puede observar un claro incremento en la intensidad fluorescente en el sitio de la activación y la re-distribución de las moléculas activadas se puede seguir sobre el tiempo usando imágenes de lapso de tiempo. Esto brinda una alternativa, y un método más directo, de rastreo molecular comparado por ejemplo, con el FRAP o FLIP.
CONFIGURACIÓN DEL MICROSCOPIO:
La activación selectiva de la PA-GFP se puede obtener en ambos microscopios fluorescentes (1) campo amplio y (2) confocal.
La unidad PA-GFP se puede montar en un microscopio invertido estándar equipada para fluorescencia. Esta unidad se coloca en el puerto posterior del microscopio y usa un láser acoplado por fibra (405nm) para iluminar un punto difractado limitado en el espécimen.
En sistemas confocales, dependiendo del tipo de láser usado, una región de interés se puede activar ya sea por la capacidad de zoom o por los espejos de escaneo o por la aplicación local de energía láser. Alternativamente, el láser puede ser controlado a través de un AOM o AOTF, permitiendo una completa flexibilidad en la definición de la región de interés.
SISTEMA RECOMENDADO:
La unidad PA-GFP de Nikon montada en un microscopio invertido Ti puede ser usada en ambas combinaciones con imagen fluorescente de campo amplio y confocal.
LIGAS:
Nota Nikon en PA-GFP [descarga]
