Cruce de Bandas CROSSTALK | Cruce / Sobrelapamiento Espectral
PALABRAS CLAVE: Fluorescencia, imagen espectral, FLIM, fluoróforo, cubo de filtros
DEFINICIÓN:
El cruce de bandas en imágenes de fluorescencia ocurre cuando el espectro de excitación y/o emisión de dos o más fluoróforos (y/o autofluorescencia) en un espécimen se sobrelapan haciendo difícil de aislar la actividad de un solo fluorocromo.
TECNOLOGÍA:
El cruce puede ocurrir tanto la emisión como la excitación de diferentes proteínas fluorescentes y se observa usualmente por la emisión de un fluoróforo siendo detectado a través de un canal fotomultiplicador o combinación de filtros u otro fluoróforos. Esto puede ser un problema en la interpretación de la imagen, por ejemplo, en estudios de colocalización y/o estudios cuantitativos. El cruce en la excitación tiende a ocurrir incrementalmente hacia las longitudes de onda más cortas mientras que el cruce en la emisión se dirige hacia las longitudes de onda más largas. Por lo tanto las imágenes multicolor de proteínas fluorescentes pueden, por lo tanto, proceder haciendo pruebas primero con las longitudes de onda más largas, usando longitudes de onda de excitación que no se crucen con las longitudes de onda de pruebas más cortas.
APLICACIONES:
La multiprueba de imágenes fluorescentes es una técnica clave en los estudios de células vivas para tráfico, interacción y localización de proteínas. El cruce puede representar un problema tanto en campo amplio como en estudios confocales.
CONFIGURACIÓN DEL MICROSCOPIO:
El problema de cruce se puede superar:
Seleccionado solamente pruebas que estén ampliamente separadas en los perfiles de excitación y emisión
Usando filtros de banda angosta (auque esto puede restringir la señal)
Usando el tiempo de vida de la fluorescencia para distinguir pruebas que se sobrelapan (en lugar de emisión)
Usando técnicas de imagen espectral (en combinación con algoritmos de separación).
SISTEMA RECOMENDADO:
El sistema de microscopio confocal espectral láser C1si de Nikon puede adquirir 32 canales del espectro fluorescente sobre un amplio rango de longitud de onda de 320nm en una sola pasada. Procesando matemáticamente los datos espectrales de pruebas cercanas que se sobrelapan (como el GFP, YFP, FITC, y Alexa 488) el C1si separa limpiamente cada emisión para brindar imágenes claras sin cruce. La separación espectral de las pruebas desde la autofluorescencia también es posible. Fácil cambio entre el detector espectral y detector fluorescencia estándar hacen que el C1si se útil para un amplio rango de aplicaciones.
LIGAS:
Parámetros de imagen para proteínas fluorescentes [microscopyu]
Nota Nikon 1: Imagen Tiempo de Vida Fluorescente (FLIM) en un microscopio confocal espectral: La última herramienta para análisis de Transferencia de Energía Resonante Fluorescente (FRET) [download]
