Confocal | Microscopia Confocal
PALABRAS CLAVE: Imagen de células vivas, imagen espectral, lapso de tiempo, fluorescencia, fluoróforos, láseres, AOM, AOTF, CLEM, resolución, proyección 3D, deconvolución, imagen multidimensional, profundidad de campo, FLIM, FRET, FRAP, FLIP, TIRF, aberración cromática.
DEFINICIÓN:
La microscopia confocal es una técnica que elimina la luz fuera de foco en los especimenes y permite obtener imágenes 3D de especímenes gruesos.
TECNOLOGÍA:
La imagen con confocal envuelve escaneos seriales al espécimen para crear secciones ópticas generadas por computadora desde 250nm de espesor usando iluminación visible. Estas secciones ópticas se pueden apilar para brindar una reconstrucción 3D del espécimen.
Hay diferentes tipos de sistemas confocales de fotón sencillo:
Escaneo láser – donde un solo punto enfocado de iluminación láser (punto o rejilla) es escaneado a través de la muestra en direcciones X, Y y Z (alternativamente, pero menos común, el rayo esta estacionario mientras el microscopio mueve la platina a través del rayo). La señal pasa de regreso al detector (foto-multiplicador) a través de un orificio de apertura muy pequeño, lo que bloquea la luz de otras regiones del espécimen.
Sistemas para imagen confocal rápida
I. Disco rotatorio – donde un disco giratorio (Disco Nipkow) con varios pequeños orificios insertado entre la fuente de luz y el espécimen. Las señales se colectan a través de los mismos orificios, que también bloquean la luz fuera de foco. Los datos se colectan usando una cámara CCD.
II. Confocal de barrido de campo – en lugar del sistema de disco Nipkow, el sistema de barrido de campo escanea el espécimen usando una ranura de luz. Los fotones iluminantes también se pueden enfocar a través de un plato con un arreglo lineal de 32 pinholes (orificios muy pequeños) así cada punto en el espécimen es iluminado hasta 260 vences por segundo. Los fotones de emisión son de-escaneados y enfocados en una cámara CCD de alta sensibilidad. Ya que los pinoles están estacionarios, el plato que los contiene puede tener un arreglo de cuatro tamaños diferentes de pinoles, permitiendo una selección del tamaño óptimo del pinhole para maximizar la resolución axial y lateral para los objetivos mas usados comúnmente. Dos ranuras diferentes se ajustan a las demandas para adquisición más rápida, mientras se mantiene la confocalidad y se reduce la foto-toxicidad.
APLICACIONES DE LA TECNOLOGÍA:
En imagen confocal, los datos de la imagen están confinados a un plano definido a través del espécimen. Este evita la interferencia de la luz emanando desde arriba y abajo de este plano. El cociente señal-a-ruido es mejorado dramáticamente comparado con las técnicas de campo amplio. La imagen confocal se asocia con más frecuencia a las técnicas fluorescentes. Esta se puede usar con especimenes fijos o vivos.
La imagen confocal fluorescente es importante en imagen de células vivas, donde se pueden identificar varias pruebas con alta resolución espacial y temporal. Se pueden obtener imágenes de eventos dinámicos en las células con la ayuda de imagen de lapso de tiempo y se pueden ver en 3D. Los sistemas de discos giratorios y de barrido de campo son ideales para la obtención de imágenes de eventos intracelulares de alta velocidad como las dinámicas de iones de calcio. La imagen confocal es fundamental para técnicas avanzadas de imagen como FLIM, FRET, FRAP y FLIP y se puede usar en asociación con imágenes de TIRF.
CONFIGURACIÓN DEL MICROSCOPIO:
Existen varios sistemas confocales Nikon desde el nivel de entrada EC1 y el sistema de laboratorio general C1, al C1si de imagen espectral. El sistema confocal de escaneo láser avanzado C1 se puede montar en cualquier microscopio de investigación ya sea vertical o invertido. El sistema LiveScan Sweptfield (de barrido de campo) se puede configurar en las series Ti o TE2000 y en el futuro próximo sobre el sistema de microscopio FN-1.
El sistema de escaneo láser confocal C1 incorpora el intuitivo programa EZ-C! para todos los parámetros de operación. El proceso de datos posteriores y el proceso de deconvolución se pueden realizar con software adicional. El sistema LiveScan SweptField incorpora al NIS-Elements para imagen multidimensional (X, Y, Z, Lambda (longitud de onda), T, puntos múltiples) con soporte para captura, desplegado, control de aditamentos periféricos y administración de datos. También ofrece sofisticadas características de procesamiento de imagen, como un módulo de deconvolución extremadamente poderoso.
Varios objetivos para adquisición de imágenes fluorescentes están disponibles (Plan Fluor, Súper Fluor, Plan Apocromático, Plan Apocromático VC, Apo TIRF). Los objetivos TIRF son ideales para imagen confocal de células vivas ya que tienen corrección de temperatura. Los lentes Plan Apocromático VC son ideales para usarse con láser de diodo de 405nm – habilitando un imagen cromáticamente corregida desde 400 – 700nm.
SISTEMA SOLUCÍON:
Para investigación de rutina de células vivas, el sistema confocal de escaneo C1 en un microscopio de las series Ti o TE2000 con CLEM, PFS e incubadora de control ambiental. Para imágenes de células vivas con lo más avanzado, alta resolución el sistema confocal Nikon LiveScan SweptFiel con el microscopio invertido Ti-E PFS con varios puertos láser, incubadora de control ambiental y platina piezo.
LIGAS:
Confocal: [microscopyu]
