Usos innovadores de amplificadores de microelectrodo de Axon  

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Axopatch 200B Amplificador de patch clamp
¡Mide el flujo interno presináptico de calcio - ópticamente!

Julio Vergara (departamento de Fisiología, UCLA) y sus colegas han tomado ventaja del desempeño de ultra bajo ruido del cabezal refrigerado CV-203BU y el amplificador  de microelectrodo Axopatch 200B en el modo patch para medir las corrientes de fotodiodo en un sistema de detección confocal spot. Usaron el indicador de calcio Oregon Green 488 e BAPTA-5N y epí-iluminación de láser de argón para medir la extensión espacial y cinética de dominios de calcio presináptica inducida por el potencial de acción, que presumen están estrechamente relacionados con los sitios responsables de la liberación del transmisor sináptico de flujo de calcio. Además, el Axopatch 200B es ideal para experimentos de fotólisis flash con este sistema, como la entrada de reinicio forzado del amplificador puede restablecer rápidamente (50µs) el cabezal capacitivo con retroalimentación después de una “liberación” de UV de alta intensidad. 

Dependencia espacial del potencial de acción (AP)-inducido por transitorios presinápticos fluorescentes.   A. Imagen CCD de terminal nerviosa cargada con 600µM OGB-5N. Derecha, diagrama de cámara clara de la misma terminal nerviosa a mayor aumento ilustrando el tamaño del punto de iluminación (círculo abierto) relativo a la terminal de nervio. La flecha indica la dirección del punto, y el asterisco indica la ubicación en la que fue adquirida el transitorio más grande.  B. Una familia de un solo AP-inducido OGB-5N transitorios de fluorescencia (trazo inferior) grabado consecutivamente en varios puntos en pasos de 0.3µm a lo largo de la línea horizontal (flecha doble en A). El trazo negro corresponde la promedio de seis puntos de acceso neuronal AP que provocaban registros de fluorescencia. EGTA (50 µM) fue incluido en la solución de la pipeta. Trazas de fluorescentes fueron filtrados a 1kHz. Dos rastros de modelo simulado se superponen en los registros experimentales (trazos puntos negros).  C. Ploteo tridimensional obtenido mediante el desvío de todas los rastros del escaneo de acuerdo con su ubicación relativa del punto. Bandas de color son incrementos de 0.05 D F/f.  Reimpreso con permiso. Copyright 1999 The Society for Neuroscience.

Microscopía Túnel de Baja Corriente
Con el amplificador de Patch Clamp Axopatch 200B

Ralph Nyffenegger (Park Scientific Instruments, Sunnyvale CA) ha hecho Interfase con un Axopatch 200B y microscopios Autoprobe CP y VP2 de Park Scientific Instruments para realizar microscopía de túnel de baja corriente (STM). Con el existente convertidor corriente/voltaje de voltaje del instrumento, el límite inferior típico de la corriente ajustada fue cercana a 50-100pA. Con la adición del Axopatch 200B, el límite de corriente en túnel se redujo en más de 100-veces, a 0.5pA. Para más información sobre esta técnica, vea el artículo Usando el Axopatch 200B para Scanning Tunneling Microscopy de corriente baja en  AxoBits 23. El cabezal CV-4 también ha sido usado para STM de baja corriente (véase Dunlap, et al. referencia más abajo). 

Grabaciones Hiperbáricas de Rebanadas Rata Brainstem
Con el Axoclamp 2A

Jay Dean y Dan Mulkey (departamento de Fisiología y biofísica, escuela de medicina de la Universidad Estatal de Wright) han utilizado una Axoclamp 2A con cabezal HS-2A en un aparato de grabación especialmente construido para obtener grabaciones intracelulares continuas y mediciones de pH en rebanadas de tronco encefálico en rata bajo condiciones cambiantes de cámara hiperbárica. Estas grabaciones técnicamente difíciles hacen posible diferenciar efectos de presión per se, de aquellas en las que el gas aumento por la presión parcial (p. ej., PO₂ PN₂ , Pco₂ ) en la misma neurona y para investigar la reversibilidad de estos efectos. Tales experimentos proporcionan información sobre los mecanismos celulares implicados en la toxicidad del oxígeno CNS, narcosis de nitrógeno y toxicidad por dióxido de carbono. 

Nota: Axón Instruments proporciona esta descripción de la grabación de las células a alta presión mediante el Axoclamp 2A y cabezal HS-2 porque pensamos que presenta una aplicación fascinante de nuestros instrumentos. Sin embargo, no endorsamos el uso de nuestros equipos de esta manera. Ninguno de nuestros productos está diseñado para su uso a alta presión. En particular, nosotros recomendaríamos no usar nuestros otros cabezales a alta presión, ya que el circuito integrado híbrido dentro del cabezal sería susceptible a los daños por la presión. 

Referencias

DiGregorio, D.A., Peskoff, A., Vergara, J.L. Measurement of Action Potential-Induced Presynaptic Calcium Domains at a Cultured Neuromuscular Junction. J. Neurosci., 19:7846-7859 (1999).

Escobar, A.L., Velez, P., Kim, A.M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergara, J. L. Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis. Pflügers Arch - Eur J Physiol, 434:615-631 (1997).

Dunlap, D., Smith, S., Bustamante, C., Tamayo, J., García, R. A very low current scanning tunneling microscope. Rev. Sci. Instrum., 66:4876-4879 (1995).

Dean, J.B. and Mulkey, D.K. Continuous intracellular recording from mammalian neurons exposed to hyperbaric helium, oxygen, or air. J. Appl. Physiol., 89:807-822 (2000).

Dean, J.B., Mulkey, D.K., Arehart, J. Details on building a hyperbaric chamber for intracellular recording in brain tissue slices. J. Appl. Physiol., see http://jap.physiology.org/cgi/content/full/89/2/807/DC1 or NAPS Document 05566, National Auxiliary Publications, c/o Microfiche Publications, 248 Hempstead Turnpike, West Hempstead, NY 11552.