Patch Clamp Automático de Alta Calidad
Con el PatchXpress
7000A cada canal está controlado de forma independiente para una
grabación de óptima calidad. Por ejemplo, el control de la presión
independiente significa mejor formación de gigasello en cada canal,
porque el tiempo para formar el gigasello puede variar mucho entre
células. Tener canales independientes significa grabaciones con menos
ruido. El control independiente de la presión también se traduce como
menos valores de resistencia de acceso células completas, con un
control más fino de este importante parámetro de la membrana.
Control de la
presión automatizada para los parámetros óptimos de membrana
Durante un
experimento de patch clamp, el electrofisiologista veterano, mantiene
un ojo en los parámetros de membrana importantes incluyendo Rm, Ra y
el mantenimiento de corriente. Los cambios en estos parámetros de
membrana señalan al patch clamper que algo podría estar saliendo mal
con la calidad de la grabación. En el peor de los casos, los cambios
en la amplitud de corriente ocurridos se refieren a los cambios en los
valores de parámetro de la membrana y no a los cambios en la biología
de la célula. El patch clamper inteligente utilizará el control de la
presión o voltaje "zaps" para optimizar estos parámetros y garantizar
mediciones confiables durante el tiempo de grabación.
El valor de la
resistencia de membrana, Rm, se relaciona al gigasello inicial
obtenido y la resistencia de entrada de la célula (en general, las
células más grandes tienen una resistencia menor de entrada porque
tienen más canales abiertos o canales "fugas" en el resto). El control
independiente de la presión y la medición automatizada en el
PatchXpress ofrece gigasellos más apretados al inicio de cada
experimento. Los gigasellos apretados son críticos para el bajo nivel
de ruido, grabaciones de células enteras estables y duraderas.
El valor de la
resistencia de acceso, Ra, se relaciona a la resistencia inicial de
electrodo más de la resistencia interna de la célula. Por ejemplo, si
los organelos internos obstruyen la entrada del electrodo planar de
patch clamp, el valor de Ra aumentará. Si el valor de Ra es demasiado
alto y la amplitud de la corriente medida es mayor a 1nA, se produce
un error de voltaje significativo debido a la Ley de Ohm (voltaje =
resistencia * corriente). Por ejemplo, si el valor de Ra alcanza un
punto de 20MΩ durante una grabación y la amplitud de corriente es 1nA
¡el error resultante del voltaje sería 20mV! Usted puede ver
fácilmente cómo esto podría conducir a un resultado falso negativo o
falso positivo durante un experimento de muestreo de compuestos. El
sistema de PatchXpress usa un control de presión automatizado para su
ventaja, manteniendo así un valor Ra relativamente constante durante
todo el tiempo de grabación.
Hidráulicos Para El
Registro De Canales Iónicos Disparado-Ligando Y Disparado-Voltaje
 |
 |
| |
Tomas del PatchXpress Animación |
|
El
PatchXpress incluye los siguientes hidráulicos:
-
Pipetas desechables para colocar
células en pozos de electrodo de SealChip16.
-
Pipetas desechables para aplicación de
pruebas de compuestos.
-
Lavado de sondas para lavado automático
de compuestos de prueba con medios.
|
La aplicación de
compuestos puede ser programada con precisión para que se produzca en
el momento en justo en la secuencia del experimento. Las puntas de
pipeta desechables garantizan que no exista contaminación cruzada
entre aplicaciones de medicamentos. El sistema hidráulico puede
configurarse para una aplicación o para aplicaciones acumuladas de
respuesta-dosis.
Como se muestra en
la figura 1, la aplicación del compuesto de prueba es lo
suficientemente rápido como para ambos estudios de canales iónicos
disparado-ligando y disparado-voltaje. La figura muestra los
resultados de los experimentos que se realiza con células RBL, células
que expresan endógenamente hacia adentro canales de potasio
rectificativos. La potencial sostenido fue -80mV y una solución
externa con alto potasio fue agregada para cambiar la corriente
sostenida. El tiempo para cambiar el 90% está en el orden de cientos
de milisegundos y está indicado por el tiempo necesario para llegar al
nuevo nivel de sostenimiento. El lavado se obtiene con una línea del
búfer separado y alcanza su pico y mesetas en alrededor de 100
milisegundos (véa la figura 1).
Figura 1.
Muestreo Tanto De
Canales Por Voltaje Como Por Ligados Es Muy Sencillo
Es razonable
esperar que un sistema de patch clamp automatizado grabe canales de
corriente-voltaje y corriente-ligando. Los electrodos planares únicos
de PatchXpress y el sistema hidráulico permiten grabaciones de patch
clamp de calidad de ambos tipos de canales iónicos.
La figura 2
muestra un ejemplo de las corrientes activadas por voltaje a través de
los canales de potasio Kv1.1 expresados en células CHO (a
partir del Dr. William Thornhill, Universidad Fordham). El Panel A
(líneas azules) muestran datos crudos sin corregir Kv1.1 en
respuesta a una familia de pasos voltaje de -60 a + 60mV en
incrementos de 10mV. Panel B (líneas rojas) muestran datos corregidos
por software con fuga lineal controlada y corrección de capacitancia
(rutina P/4). Como se muestra en las curvas I-V en el panel C, las
grabaciones son estables y similares con o sin la rutina P/4.
Figura 2.
Corrientes de canal de potasio Kv1.1 con (A) datos sin procesar y (B)
fuga lineal P/4 y capacitancia datos restados. El panel C muestra la
relación de I-V de ambos
experimentos. Datos cortesía de los
doctores Jia Xu y Antonio Guia (AVIVA Biosciences).
La figura 3
muestra un ejemplo de ligando desensibilizado activado corrientes en
respuesta a la aplicación directa de 100µM y 1mM acetilcolina (Ach) en
la misma célula patch-clamped con un electrodo planar. Las grabaciones
automatizadas de patch clamp de células completas (sosteniendo un
potencial de -80mV) iniciadas con un gigasello (> 1GΩ). Transición a
modo de células completas también fue bajo control automatizado
mediante un amplificador controlado por software (MultiClamp 700A) y
controlador de presión. Las corrientes hacia adentro fueron grabadas
en respuesta a ACh aplicada usando el sistema robótico hidráulico del
PatchXpress. El tiempo de contacto con ACh se indica por la longitud
de la barra. El pozo fue lavado usando tuberías de perfusión situadas
muy cerca de la base del pozo de grabación para lograr un lavado
rápido.
Figura 3.
Corrientes de ligando activado en respuesta a
aplicación directa
de 100µM y 1mM acetilcolina.
Software PatchXpress Monitorea Experimentos de Patch
Clamp:
Un Electrofisiólogo Virtual
El sistema
nervioso central del PatchXpress es su software. Además del control
directo de los sistemas de hardware del PatchXpress, el programa del
PatchXpress toma decisiones críticas mientras se ejecuta un
experimento, de la misma como una path clamper experimentado lo haría
— con el fin de mantener el experimento en marcha.
El software del
PatchXpress hace la instalación experimental intuitiva y amigable al
usuario. Incluso es posible para los usuarios de pCLAMP importar sus
conocidos archivos de episodios parámetricos.
Durante los
experimentos, el software de PatchXpress controla magistralmente toda
la instrumentación robótica mientras muestra información útil al
usuario a cerca del estado de los experimentos de patch clamp en cada
uno de los 16 canales.
Esta es una
secuencia de eventos durante un experimento típico bajo el control del
software del PatchXpress:
|
è
Carga
electrodo SealChip16
è
Carga
electrodos con solución interna
è
Aplicar
células
è
Aplicar
sólo la cantidad correcta de presión para obtener una
gigasello
è
Aplique
presión hasta que se logre la configuración de células
completas
è
Iniciar
protocolo de paso voltaje y grabe las corrientes de línea de
base
è
Monitorear los parámetros de membrana
è
Aplicar el
compuesto de prueba
è
Iniciar el
Protocolo de paso de voltaje y grabación de las corrientes
è
Lave el
compuesto de prueba
è
Iniciar el
Protocolo de paso de voltaje y grabación de las corrientes
è
Crear
bitácora de registro de control de calidad con información
detallada sobre el experimento (vea la figura de ejemplo)
|
El paso "monitoreo
de los parámetros de membrana " se resaltaron porque merece una
aclaración. Antes de cada pantalla, el usuario predefine los criterios
aceptables para una grabación exitosa. Por ejemplo, la tolerancia para
Ra y Rm puede ser 15MΩ y
500MΩ, respectivamente. En este caso, si Ra va por encima de 15MΩ y/o
Rm por debajo de 500MΩ el software de PatchXpress debe actuar
rapidamente. El primer paso sería aplicar succión (presión negativa)
en un esfuerzo para limpiar cualquier obstrucción (es decir, orgánelos
internos) que podrían ser responsables del aumento en la Ra. En un
escenario optimista, esta presión negativa también mejorará el sello y
causará que Rm regrese (o permanezca) por encima de 500MΩ. En el peor
de los casos, el software haría una nota que no se cumplen los
criterios para una grabación exitosa y esto sería evidente en la
interfase del usuario. Lo que es importante, en este último caso,
es que el valioso compuesto de
prueba no se aplicaría a esta célula. El software de PatchXpress y la
robótica de pipeteado trabajan juntos para aplicar compuestos de
prueba sólo a las células que cumplen los criterios para una grabación
exitosa.
La salida de datos
del PatchXpress será en forma de archivos de texto estándar y archivos
binarios de Axon (ABF). Estos archivos ABF se pueden importar al
DataXpress para análisis automatizado o al Clampfit para un análisis
manual detallado. Algunos análisis en-línea, como por ejemplo
amplitudes de pico de corriente, también están disponible durante
experimentos de PatchXpress (y exportados como archivos de texto).
El DataXpress es
una aplicación de base de datos diseñada para la gestión de datos y
análisis de lote automatizado, manejado por macro. El DataXpress
generará automáticamente gráficos IV y gráficos respuesta-dosis. Los
datos en línea de los experimentos de PatchXpress pueden ser enviados
directamente a DataXpress, donde se muestran los aciertos y errores en
una pantalla de medicamentos.
La figura 4.
Un ejemplo de los parámetros de membrana grabado durante un
experimento de la patch clamp plano que muestra la calidad de la
grabación. En este ejemplo, Ra mantenido por debajo de 15 MΩ y Rm se
quedó por encima de 500 MΩ durante más de 15 minutos. También se
muestran los valores de capacitancia actual y de célula de toda
explotación.
Dos Décadas de Experiencia
El PatchXpress
7000A emerge de años de experiencia de Axon como el líder mundial en
software y hardware de electrofisiología. Durante las últimas dos
décadas, Axon brindó herramientas a electrofisiólogos para realizar
investigación de vanguardia en canales iónicos tanto en laboratorios
de la empresa farmacéutica como en académicos. El PatchXpress 7000A se
basa en estas tecnologías núcleo e incluye la revolucionaria
tecnología de SealChip que permite grabaciones de muchas células en
paralelo para un mayor rendimiento para la detección de canales
iónicos.
Amplificadores MultiClamp: El Caballo De Batalla Silencioso
Escondido
en el PatchXpress 7000A son ocho amplificadores 700A MultiClamp, cada
uno conectados con dos headstages de CV-7A. Estos amplificadores de
patch clamp controlado por ordenador han sido probados en el campo
durante más de dos años y son ideales para revisión automatizada de
sujeción porque no hay pomos y botones. El software de PatchXpress
controla la configuración de cada canal de amplificador, permitiendo
al usuario tomar decisiones como las siguientes:
è
clamp corriente
versus clamp voltaje
è
50MΩ, 500MΩ, 5GΩ
o resistencias de
retroalimentación de 50GΩ de clamp de voltaje
è
configuración de
filtros 60de paso bajo Bessel
Al incorporar los
amplificadores MultiClamp, el PatchXpress 7000A le brinda la
flexibilidad para realizar experimentos de modo de investigación
detallada o experimentos de alto rendimiento de muestreo: ambos con la
misma alta fidelidad y datos de calidad que los clientes de Axon han
disfrutado durante los años.
Adquisición De Datos
De Patch Clamp: Nuestra Especialidad
Pregunte
a cualquier Electrofisiólogo cual es el estándar de la industria de
software de electrofisiología, y la respuesta será, sin duda, pCLAMP.
El desarrollo de software de electrofisiología flexible y fácil de
usar es una tarea desalentadora. Hemos logrado esto con pCLAMP, con
cerca de dos décadas de experiencia detrás de cada nueva versión de la
actualización. Esta misma experiencia entró en desarrollo de software
de PatchXpress.
Para
aplicaciones de patch clamp convencionales, la Digidata 1322A (ver la
figura) facilita la comunicación desde la computadora a los
amplificadores (conversión digital a analógico de "D - A"), así como
de los amplificadores a la computadora (conversión de analógico a
digital o "A - D"). La PatchXpress incorpora un Digidata modificado
que tiene 16 entradas análogas y salidas (la Digidata 1322A de tiene
sólo dos salidas analógicas).
El PatchXpress
7000A también se basa en la experiencia adquirida por el OpusXpress
6000A, primer sistema de grabación de electrofisiología de paralelo en
todo el mundo. En el desarrollo de la OpusXpress, Axon adquirió una
valiosa experiencia en hidráulica y software
de adquisición de electrofisiología para aplicaciones de muestreo de
canales iónicos. La siguiente cita de OpusXpress por el usuario Dr.
Roger Papke (Universidad de Florida), describe la ventaja de utilizar
sistemas automatizados de clamp voltaje de alta calidad:
| "Con las líneas de productos
PatchXpress y OpusXpress, Axon ha traído la calidad de la
investigación académica a las necesidades de alto rendimiento
de investigación de medicamentos y desarrollo. Al mismo
tiempo, ofrece un nivel sin precedentes de productividad
potencial al investigador académico qué tiene acceso a estos
sistemas. Nuestro laboratorio tuvo la suerte de participar en
el programa beta de prueba OpusXpress. En el curso de un mes
se completamos un proyecto que de lo contrario podría han
durado hasta dos años." |
Características
y Especificaciones
El PatchXpress es
una estación de trabajo automatizado de alto rendimiento de
electrofisiología. >
è
Automatizada de grabación de patch clamp paralelo de
células de mamífero múltiples simultáneamente
è
Gigasellos (resistencia adjunta de célula > 1GΩ) para
iniciar cada grabación
è
Verdaderas grabaciones célula-completa
è
Valores de resistencia (Ra) de acceso bajo logrados por
los 16 controladores de presión independientes
è
16
Amplificadores independientes de patch clamp
è
Digitalizador de entrada y salida de 16 canales de alta
fidelidad basado en la tecnología comprobada de la 1322A
de Axon Instruments Digidata
è
Dimensiones: 58" ancho x 30" profundo x 66" altura (más
24" monitor conectado al lado)
è
Voltaje de toda célula de alta velocidad y capacidad de
abrazadera de corriente
è
8
MultiClamps con 16 cabezales CV-7A (una tecnología
comprobada)
è
4
resistores de retroalimentación diferentes en modo clamp
de voltaje ya sea que las corrientes están en el rango de
pA o nA
è
Clamp
de corriente verdadero y rápido ya que los cabezales CV-7A
incluyen un circuito de seguidor de voltaje
è
Un
solo uso del electrodo sustrato
patch
clamp plano (16-canales)
è
Chips
de Aviva con la tasa de éxito de muy alto célula completa
para grabación (gigasello, 15 minutos de duración, Ra <
15MΩ (corregida) y Rm > 200MΩ)
è
Formato planar permite agregar compuesto desde la parte
superior
è
Electrodo/cámara desechable significa ninguna
contaminación cruzada
è
Hidráulica integrada e inteligente facilita la aplicación
de medicamentos durante grabaciones
è
Compuestos de prueba se agregan sólo a las células con
grabaciones exitosas para eliminar el desperdicio de los
materiales preciosos
è
Soporta lavado de cámara
è
Intercambio de solución rápida
è
Pequeños volúmenes de compuestos de prueba (~ 50µl)
è
Puntas
desechables para eliminar la contaminación cruzada
è
Experimentos acumulativo de dosis-respuesta
è
Software de adquisición y análisis integrado
è
16
ventanas de alcance para vistas en vivo de grabaciones de
los 16 canales
è
"Registrador" ventanas para la visualización de
estadísticas en línea, tales como la amplitud de pico
sobre tiempo
è
Monitor de pantalla ancha para su visualización fácil de
16 ventanas de alcance y ventanas "registrador"
è
Salida
de archivo de texto que muestra hits basados en criterios
de usuario
è
Análisis de software para administración de datos,
gráficos rápidos I - V y curvas rápidas de dosis-respuesta
&nbs
Información de pedido
PatchXpress 7000A >
è
Paquete integrado de hardware y software viene completo
con todo el hardware, electrónica y software necesario
para el funcionamiento completo, incluido un equipo
totalmente configurado con el software de PatchXpress.
