Muestreo Electrofisiológico de Alta Salida

Los canales iónicos son algo viable y una clase bajo-representada en la industria farmacéutica. El patch clamp convencional de una célula a la vez, un “estándar de oro” para el estudio de los canales iónicos, es una intensiva labora y no es favorable muestrear gran numero de compuestos en las primeras etapas de descubrimiento de medicamentos. Como resultado, se sustituyen mediciones de la actividad de los canales iónicos, como el desplazamiento del ligando, flujo iónico y potencial de membrana que son usados, pero estos ensayos no pueden mantener una población de canales iónicos en particular en estado conformacional debido a la falta de control de voltaje. Los recientes avances en la tecnología de patch clamp planar comenzaron en la era del muestreo de canales iónicos usando ensayos electrofisiológicos directos, y varios instrumentos están disponibles de forma comercial, incluyendo el IonWorks® HT y el PatchXpress® 7000ª, ambos sistemas de Molecular Devices. Aun cuando estos sistemas ofrecen una salida considerablemente mayor que el sistema de patch clamp convencional, aun existe la presión de empatar la salida de ensayos sustitutos, mientras que de forma simultánea se reduce el precio por ensayo de compuesto. Para alcanzar la meta, Molecular Devices desarrollo el sistema IonWorks® Quattro™ con tecnología de Población de Patch Clamp™ (PPC).

El sistema IonWorks Quattro™ de Molecular Devices – la herramienta de siguiente generación para muestreo de canales iónicos:

è    Tecnología de Población de Patch Clamp™

è    Consistencia y calidad de datos

è    Farmacología hERG

è    Compatible con el consumible original PatchPlate™

è    Incremente la salida a la cuarta potencia sobre el IonWorks® HT

è    Reducción de costo por punto de datos

è    Especificaciones

Animación IonWorks Quattro

Tecnología Población Patch Clamp™

La variabilidad biológica (p. ej. Salud celular, tamaño celular, y niveles de expresión de canales) el factor que más contribuye para tener promedios de éxito bajo en los sistemas de patch clamp planar. Para compensar, el sistema IonWorks HT fue diseñado inicialmente para aumentar la posibilidad de obtener cuando menos una grabación exitosa para cada compuesto pipeteando compuestos en cuadruplicado. Por lo tanto la probabilidad de obtener cuando menos una grabación para cada compuesto usando una línea celular con 70% el promedio de éxito es de 99.2%; esto tiene el costo de una baja salida. Un incremento de cuatro veces en la salida se puede realizar inmediatamente con el sistema IonWorks HT eliminando los cuadriplicados. Para obtener este objetivo, Molecular Devices desarrolló la tecnología Población Patch Clamp™ (PPC), un acercamiento revolucionario que graba los promedios de corrientes iónicas de una población de células expresando un canal iónico recombinado activado por voltaje. Las células  son emplatadas en un PatcPlate™ PPC de 384 pozos con un sustrato en el que cada pozo contiene varios sitios de grabación (Figura 1).

Figura 1. El sistema IonWorks Quattro usa la tecnología Población Patch Clamp™ Cada pozo del sustrato del PatchPlate PPC contiene varios sitios de grabación.

Consistencia y Calidad de Datos

Ya que las corrientes de los canales iónicos se miden desde una población de células, el promedio de corriente medido durante experimentos en el sistema IonWorks Quattro tiene una reducción significativa de la variación de los valores de coeficiente. El %CV para corrientes K_v 1.3 es del 8% contra el 34% de los sistemas IonWorks Quattro y IonWorks HT respectivamente; para corrientes Na_v 1.5, 18% contra 44% respectivamente; y para las corrientes hERG, 28% contra 50% respectivamente. Los trazos de datos crudos de las grabaciones PPC se muestran en la Figura 2

Figura 2. Datos crudos representativos para rastreos de corriente desde Kv1.3, Nav1.5, y hERG medidos en el IonWorks Quattro usando un sustrato PPC PatchPlate.

Los promedios de éxito son tan altos (arriba del 95%, Tabla 1) que no es necesario aplicar compuestos de prueba en forma redundante a los 4 pozos, por lo tanto habilita una salida 4 veces mayor sobre la primera generación del IonWorks HT. Los promedios de éxito para las líneas celulares expresando K_v1.3, Na_v1.5 y hERG se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1. Comparación de promedios de éxito (%) entre el IonWorks Quattro y el HT.

Prueba-t de dos colas sin par <0.01

La calidad mejorada de los datos trae la estabilidad y consistencia que se requiere para el muestreo sólido de un punto y ensayos farmacéuticos para blancos de canales iónicos. La variabilidad entre pozo-y-pozo es tan consistente en los experimentos del IonWorks Quattro que los altos factores-Z’ se pueden obtener, y son similares a los valores Factor-Z’ calculados desde 32 pozos de controles positivos (6mM 4-AP) y 32 pozos de control negativo (solo medio extracelular).

Figura 3. Factor-Z’ para Kv1.3 experimento farmacológico en el sistema IonWorks Quattro. Respuesta-dosis 10-puntos de 4-aminopiridona (4-AP), normalizada para controlar (pre-compuesto) tamaño de corriente. La placa compuesta de 384 pozos contenía 32 titulaciones replicadas 4-AP. El Factor-Z fue calculado desde los 32 pozos de control positivo (6nM 4-AP) y 32 pozos del control negativo (solo medio extracelular).

El incremento de salida del sistema IonWorks Quattro es ideal para generar comprensivamente determinaciones farmacológicas de docenas de compuestos en un solo experimento. Usando platos de 96 – 384 pozos, se puede diseñar una amplia variedad de experimentos de dosis-respuesta, incluyendo cualquier número de valoración de concentración desde 3 a 12 – con o sin repeticiones. La figura 4 ilustra distribuciones más cerradas de datos desde un experimento K_v1.3 de farmacología usando el sistema IonWorks Quattro contra el sistema IonWorks HT. Cada punto de datos se compone de 4 repeticiones por concentración: tenga en cuenta las considerablemente más pequeñas barras de error en los datos generados en el sistema de IonWorks Quattro versus el sistema de IonWorks HT.

Figura 4. Comparación de valores IC₅₀ para la inhibición de la AP-4 de K_v1.3 canales expresados en celulas CHO, obtenidas en los sistemas de IonWorks HT (izquierda) y IonWorks Quattro (derecha).

Farmacología hERG

Las determinaciones de potencia para ocho compuestos de referencia con actividad conocida de hERG (astemizola, cisaprida, pimozida, flunarizina, quinidina, terfenadina y dofetilida) fueron probadas en el sistema de IonWorks Quattro utilizando el orificio único y sustratos PPC. La variabilidad de los datos fue considerablemente menor cuando se utiliza el sustrato PPC PatchPlate relativa a la versión de orificio único (figura 5). Una comparación de los valores de potencia obtenidos utilizando solo agujero y sustratos PPC, junto con una comparación de los valores obtenidos en la literatura para electrofisiología de patch de célula completa en electrofisiología de patch clamp se resumen en la tabla 2. La mayoría de los valores, con excepción de la flunarizina, está dentro del triple de la media de los valores reportados en la literatura para patch clamp convencional. La flunarizina es un compuesto de actuación lenta que no llegó a la inhibición de estado-listo incluso después de 10 minutos de estimulación continua usando patch clamp convencional (los datos no se muestran), lo que podría explicar el desplazamiento de la derecha observado en IonWorks Quattro, ya que el Protocolo de estimulación utilizado se limitaba a cinco pulsos durante un período de ~ 5 segundos.

Figura 5. Determinaciones de potencia para ocho bloqueadores conocidos de hERG en IonWorks Quattro. Comparación de los valores obtenidos mediante el PatchPlate original (orificio único, panel de la izquierda) y sustratos PatchPlate PPC (panel de la derecha). Las densidades de siembra de las células fueron 5 x 10₅ células/mL para orificio único y 2 x 10₆ células/mL para experimentos PPC.

Tabla 2. Correlación de valores IC50 (en µM) para bloqueadores hERG en los sistemas IonWorks Quattro e IonWorks HT y de electrofisiología convencional de patch clamp.

Compatibilidad con el Consumible Original de PatchPlate

El sistema de IonWorks Quattro es compatible con el PatchPlate de orificio único original y los nuevos consumibles de PPC de PatchPlate. Un nuevo amplificador fue diseñado para el sistema de IonWorks Quattro, permitiendo al usuario cambiar entre las dos opciones de PatchPlate. El usuario simplemente selecciona el tipo de PatchPlate al configurar el protocolo experimental en el software antes del comienzo de cada experimento.

Rendimiento Cuatro Veces Mayor Sobre IonWorks HT

La tecnología Población Patch Clamp permite un incremento del cuádruple en el rendimiento sobre el sistema de IonWorks HT — es el sistema electrofisiológico automatizado de mayor salida en el mercado. El número máximo de puntos de datos al año utilizando el sistema de IonWorks Quattro es 400.000.

Reducción de costo por punto de datos

Debido a la mayor velocidad de transferencia del sistema IonWorks Quattro, el costo por compuesto probado se reduce significativamente por más del 50% relativo al sistema IonWorks HT.

Especificaciones *

* Las especificaciones están sujetas a cambios.